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一株溶藻弧菌H1B6的分离与鉴定

发表时间:2019/3/26 16:47:34  
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作者:李卓昱1,鲍玉杰1,尚玉曼1,袁增智1,2*

单位:1.天津师范大学生命科学学院;2.天津市动植物抗性重点实验室

简介:李卓昱,硕士研究生,研究方向:水生生物分子生物学。*通信作者,讲师,从事水产动物病害学研究。

基金项目:天津师范大学博士基金资助项目(52XB1412)。


半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)是我国北方重要的海水养殖鱼类,隶属鲽形目(Pleuronectiformes)舌??疲?/span>Cnoglossidae)舌鳎属(Cynoglossus),作为一种深受广大消费者欢迎的鱼种,具有较高的经济食用价值。近年来,各类疾病的出现使半滑舌鳎的健康状况和养殖事业受到极大威胁,其中以细菌性疾病居多。

为进一步阐明养殖半滑舌鳎体表溃疡病病原及发病机制,笔者开展了相关病原菌的筛选工作,并从患溃疡病的半滑舌鳎体表筛选出一株溶藻弧菌,编号为H1B6,从形态观察、生理生化鉴定、Biolog微生物鉴定、16S rDNA序列分析方面对分离菌株进行了鉴定,旨在探究其致病性,为今后半滑舌鳎溃疡病的防控与治疗提供一定的科学依据。

论文|一株溶藻弧菌H1B6的分离与鉴定

1

材料与方法

1.1

材料

培养基:TCBS和2216E琼脂。

试剂:2×TaqPCR Master Mix购自博迈德生物有限公司;生化鉴定管购自杭州微生物试剂有限公司;Biolog GEN Ⅲ 鉴定板购自基因有限公司。

仪器:超净工作台(SW-CJ-1FD,江苏通净)、高压灭菌锅(SX-500,江阴滨江医疗有限公司)、pH计(METTER TOLEDO,北京六一仪器厂)、离心机(Centrifuge5415R Eppendorf)、PCR仪(BIO-RAD)、恒温培养箱(SPX-150B-D,上海博讯实业有限公司医疗设备厂)、数显恒温水浴锅(HH-3A型,金坛市金南仪器制造有限公司)、电泳仪(DYY-6C型,北京六一仪器厂)、全自动微生物鉴定系统(MicroStation Biolog)。

试验动物:患病的半滑舌鳎、攻毒用斑马鱼。

1.2

方法

取患溃疡的半滑舌鳎进行病原菌的分离,对分离得到的优势菌株进行16S rDNA检测、生理生化鉴定、Biolog微生物鉴定、斑马鱼攻毒试验。

2

结果与分析

2.1

病鱼临床症状

患体表溃疡病的半滑舌鳎发病前期体表出现大量白色溃疡点,活力减弱,摄食减少。随着病情的加重,溃疡面积逐渐增大,可引发大面积溃烂现象,甚至断尾,肠道肿大、鼓出,几乎脱出肛外(图1),严重时可致死。

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图1 患溃疡病的半滑舌鳎

2.2

病原菌分离结果及形态特征

该试验筛选到一株优势菌株,编号H1B6,革兰氏染色结果呈阴性,呈短杆状(图2)。

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图2 H1B6菌株的革兰氏染色结果

该菌株在2216E培养基上呈1~2mm圆形状,无色透明,有扩散趋势,有黏性,不易挑起。该菌株在绿色TCBS培养基上为黄色圆形菌落,表面光滑,富有黏性,见图3。

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图3 TCBS培养基上H1B6菌株的菌落特征

2.3

16S rDNA序列分析及进化树分析

以细菌DNA为模板,对其进行16S rDNA基因的PCR扩增,发现条带单一,有一条1 500bp左右大小与预期相符的单一条带(图4)。将序列拼接片段在NCBI网站上进行BLAST比对,发现菌株16S rDNA基因为弧菌属,其中与副溶血性弧菌(序列号为KX860115.1)同源性高达100%,与溶藻弧菌(序列号为KT986175.1)同源性也高达100%,由此可初步判定H1B6致病菌为弧菌属。

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注:M.DNA marker;1.16S rDNA

图4 H1B6菌株16S rDNA序列的PCR扩增结果

与找到的与其同源性较高的序列进行系统发育进化树分析(图5),结果显示H1B6菌株与溶藻弧菌聚为一支。

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图5 H1B6菌株16S rDNA序列系统进化树分析

2.4

生理生化鉴定

生化鉴定结果(表1)表明,该菌株在3%NaCl中可正常生长,可将葡萄糖分解为丙酮酸,丙酮酸继续分解,产生甲酸、乳酸等,在M-R反应中呈阳性。对蔗糖、甘露醇、赖氨酸、鸟氨酸的利用呈阳性,不可利用乳糖、精氨酸和硫化氢,V-P反应呈阴性。将鉴定结果与《伯杰氏细菌鉴定手册》中弧菌属性状进行比较,可确定H1B6菌株与溶藻弧菌最为相似。

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2.5

Biolog微生物鉴定结果

利用GENⅢ鉴定板对菌株H1B6的碳源利用及化学敏感性进行检测,鉴定结果如图6所示。菌株H1B3呈阳性反应的有24个,呈阴性反应的有42个,呈边界值反应的有30个。碳源利用检测呈阳性反应的有11个,呈阴性反应的有36个?;舾行约觳獬恃粜苑从Φ挠?3个,呈阴性反应的有6个。根据2个重要的鉴定参数SIM(相似性)及DIST(距离)可知,当SIM越接近于1,则相似性越高;若DIST小于5,即可确定其菌株分类。

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图6 菌株H1B6在GENⅢ鉴定板上的鉴定结果

Biolog鉴定结果如表2所示,H1B6菌株为溶藻弧菌的PROB(可能性值)为0.986,SIM和DIST值均在可接受范围内,因此确定H1B6菌株为溶藻弧菌。

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2.6

斑马鱼毒力试验结果

毒力试验结果如表3所示,腹腔注射6h开始,Ⅲ、Ⅳ组斑马鱼表现出明显的食欲不振、活力下降、失去方向感,并开始死亡。

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观察死鱼发现其体表充血,鱼体泛白,黏液增多,腹部肿胀,尾部呈上翘状,具有典型的急性细菌侵染败血症病理变化特征,如图7所示。Ⅳ组12h死亡率达100%,Ⅲ组24h内全部死亡,Ⅱ组累计死亡率仅为20%,此后再无死亡现象,Ⅰ组和空白对照(CK)组无死亡现象。使用SPSS 16.0统计软件建立线性回归方程y=107x-414286(R2=0.9884),由该公式计算出H1B6菌株的24h LD50值为4.58×106CFU/mL。

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注:A.感染斑马鱼;B.健康的斑马鱼

图7 感染溶藻弧菌斑马鱼的临床症状

3

讨 论

从患病的半滑舌鳎溃疡体表处筛选到一株H1B6优势菌株,根据形态观察、16S rDNA检测、生理生化鉴定结果,H1B6菌株与溶藻弧菌最为接近,而在以16S rDNA序列构建的系统发育进化树模型中,H1B6菌株也与溶藻弧菌菌株聚为一支。Biolog微生物鉴定结果显示,H1B6菌株为溶藻弧菌的可能性为98.6%,确定H1B6菌株为溶藻弧菌。斑马鱼攻毒试验结果显示,H1B6菌株24h的半数致死浓度(LD50)为4.58×106CFU/mL。

该研究中也将斑马鱼作为检验分离菌株毒力的模型。通过人工感染试验发现,H1B6菌株对斑马鱼具有急性感染能力,毒力较强,提示该菌可能是导致半滑舌鳎体表溃疡病的病因之一。在此基础上,今后还需要开展进一步的研究工作,以探索该菌株的致病机制以及对半滑舌鳎的致病力,为半滑舌鳎体表溃疡病的防治奠定理论基础。

(安徽农业科学 2019年05期)

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